Deterioração de Silagens
A manutenção da anaerobiose e a queda do pH constituem os fatores que são responsáveis pela preservação da forragem armazenada (DRIEHUIS; OUDE ELFERINK; SPOELSTRA, 1999; PAHLOW et al., 2003), pois os microrganismos capazes de deteriorar a silagem são inibidos pelo efeito sinérgico dos ácidos produzidos durante a fermentação, pela pressão osmótica elevada e pela ausência de oxigênio (WOOLFORD, 1990).
Quanto aos fatores ligados à acidificação da massa, estes são obtidos quando ocorre predominantemente fermentação homolática (DRIEHUIS; OUDE ELFERINK; SPOELSTRA, 1999) e podem ser alcançados com facilidade, por exemplo, na cultura do milho, devido às suas características desejáveis relacionadas a capacidade de fermentação (alta concentração de carboidratos solúveis, baixo poder tamponante e umidade reduzida) (ALLEN; COORS; ROTH, 2003).
O contato da massa com o oxigênio é inevitável durante algumas fases que compreendem o processo de ensilagem (abastecimento do silo, armazenamento e desabastecimento). Segundo Sprague (1974), citado por Woolford (1990) e reiterado por Pahlow et al. (2003), em um silo bem vedado o O2 presente na massa é consumido rapidamente pelo processo de respiração celular e pela microbiota (microrganismos aeróbios facultativos), pois em 15 minutos cerca de 90% do oxigênio é removido e menos de 0,5% remanescente permanece após 30 minutos.
De fato, a maior quantidade de oxigênio que permeia a silagem se deve à consequência do escape de CO2 da massa que “bombeia” oxigênio para o interior do silo, buscando o equilíbrio dos gases (PITT; MUCK, 1993). Pelo fato do silo não ser ambiente hermético, durante o período de armazenamento o ar penetra no seu interior (MUCK; MOSER; PITT, 2003), principalmente no topo e nas zonas laterais em contato com a parede (BOLSEN et al., 1993), sendo que este problema pode se agravar, sobretudo durante o fornecimento da silagem aos animais (HONIG, 1991).
A presença de O2 desencadeia a proliferação de microrganismos indesejáveis presentes na massa (leveduras, fungos e bactérias aeróbias) que se desenvolvem utilizando reservas energéticas presentes na forragem, acarretando em perdas no valor nutritivo da silagem e redução do consumo voluntário da forragem pelos animais (LINDGREN; JONSSON; LINGVALL, 1985).
No Brasil, devido a negligência aos processos de oxidação de nutrientes pelos microrganismos aeróbios e a, conseqüente, deterioração da silagem, pouca importância tem-se dado à esse assunto na prática, por se tratar na maioria das vezes de um problema assintomático. A dificuldade em se mensurar as perdas totais que ocorrem por manejo inadequado nas propriedades rurais e, a não mensuração de perdas qualitativas por meio de avaliações laboratoriais, resultam em falta do estímulo à percepção e à divulgação de resultados para a economia do processo.
Dificilmente os produtores acreditam em perdas elevadas decorrentes de oxidação da massa, pois só consideram como tal aquelas que são visíveis (com presença de micélios), o que subestima as perdas reais envolvidas na ensilagem.
Apesar de antigo e muito estudado, o assunto instabilidade aeróbia de silagens somente começou a receber atenção recentemente. Várias causas podem estar relacionadas a este fato, pois poucos são os trabalhos, como os de Ruppel et al. (1995) e Kuzin e Savoie (2001) que se dedicaram a estudar a importância dos fatores inerentes ao manejo e mais raros os que caracterizaram o efeito da silagem deteriorada e de seus produtos (aminas biogênicas, micotoxinas) sobre a ingestão e metabolismo dos animais, como os trabalhos de Bolsen; Whitlock e Uriate-Archundia (2002) e Tabacco e Borreani (2002).
O tema deterioração aeróbia não se limita as questões relacionadas às perdas, porque o desenvolvimento de microrganismos, como algumas espécies de bactérias (Bacillus, Clostridium e Listeria) e alguns fungos filamentosos podem influenciar nos aspectos ligados a qualidade higiênica da silagem (LINDGREN; OLDENBURG; PAHLOW, 2002). O crescimento de fungos pode vir acompanhado pela produção de micotoxinas na massa.
Dessa forma, os animais que são alimentados com grandes proporções de silagem na ração (vacas leiteiras) podem intoxicar-se, causando efeitos diretos ao seu desempenho e colocando em risco a saúde humana que utiliza alimentos de origem animal ao longo da cadeia alimentar (WHITLOW; HAGLER JR, 1997).
1. Fatores que influenciam na deterioração aeróbia
1.1. Influxo de ar no silo
Segundo Savoie e Jofriet (2003) os efeitos danosos do ar na qualidade da silagem são manifestados por dois caminhos, o primeiro ocorre na camada superficial durante o armazenamento, frequentemente visível pelo crescimento de fungos, e o segundo está ligado à estabilidade aeróbia durante o período de remoção e fornecimento da silagem, usualmente manifestado pelo aquecimento da massa.
As trocas gasosas durante o período de estocagem são fundamentadas, segundo o modelo de McGechan e Williams (1994), por dois efeitos físicos: o fluxo volumétrico e a difusão. O fluxo volumétrico é dependente dos gradientes de pressão, sendo que estes são influenciados principalmente pelo movimento de CO2 (principal gás produzido na fermentação) entre o silo e o ar (HONIG, 1991). Após o término da fermentação, a concentração interna de CO2 é de 90%, muito superior à externa (McGECHAN; WILLIAMS, 1994).
Se o silo apresenta algum ponto de escape, ocorre saída de CO2, o qual é substituído por O2 e N2 (ASHBELL; LISKER, 1988), sendo estes governados dentro do silo por difusão (McGECHAN; WILLIAMS, 1994). A intensidade do fluxo é dependente dos gradientes de temperatura, presença de fendas na parede do silo, do filme plástico utilizado na vedação e da porosidade da silagem (WEINBERG; ASHBELL, 2003).
1.2. A vedação e a penetração de ar
A lona que veda o silo protegida com terra, areia ou cascalho aumenta a adesão entre esta e a massa e diminui a incidência de raios solares e as trocas gasosas com o ambiente. Porém, pode representar grande demanda de mão-de-obra, seja durante a vedação ou na retirada da silagem, principalmente quando o silo é de grande porte.
Por estes motivos, quando materiais extras não são adicionados na cobertura, a lona passa a assumir uma contribuição mais expressiva na etapa de vedação do silo, objetivando a redução da penetração de ar do ambiente externo para o interior.
Em silos do tipo superfície, a presença da lona também se torna relevante, devido à falta de amparos laterais para proteção (SAVOIE; JOFRIET, 2003), e a demanda por filmes mais espessos (0,18 a 0,2 mm) acaba sendo mais significativa, segundo o modelo proposto por Savoie (1988).
Os filmes de polietileno utilizados na cobertura de silos apresentam permeabilidade ao oxigênio, que aumenta notavelmente com a elevação da temperatura ambiental (DEGANO, 1999). Isto significa que durante o período do verão as silagens podem se tornar mais propensas à deterioração aeróbia, devido ao aumento da permeabilidade das lonas, com o consequente movimento gasoso devido à diferença de temperatura e pressão.
Kuzin e Savoie (2001) desenvolveram um modelo com o objetivo de estudar diferentes espessuras de filmes de polietileno e qual o impacto que os diversos níveis de permeabilidade ao oxigênio poderiam exercer sobre as perdas da silagem. Considerando a profundidade de 3 m ao longo do perfil, o filme com espessura aproximada de 0,1-0,2 mm (comumente comercializado) promoveu menos de 2% de perdas de matéria orgânica após 7000 horas de armazenamento, enquanto que na espessura de 0,001 mm verificou-se 10% de perdas. Segundo os autores, quando o período de estocagem for próximo de 125 dias pode-se utilizar filme com espessura de 0,1 mm e se o tempo for estendido para 300 dias a espessura deverá ser de 0,2 mm.
Snell et al. (2002) utilizaram silos experimentais (0,3 m3) para avaliar a influência de variações na coloração e na espessura do plástico sobre as condições de preservação e qualidade da silagem, sendo comparados cinco tipos de filmes plásticos: a) branco/0,09 mm, b) transparente/0,15 mm, c) branco/0,15 mm, d) preto/0,15 mm, e e) branco/0,2 mm.
As características de fermentação da silagem não foram afetadas pelo tipo de filme. Houve diferença na temperatura da superfície externa dos plásticos, sendo que as silagens cobertas por plásticos preto e transparente tiveram valores superiores. Foi observada diferença de temperatura na camada de silagem próxima ao filme (0 a 20 cm), porém esta foi insuficiente para influenciar as condições de desenvolvimento de microrganismos.
Segundo as normas da American Society for Testing and Materials Standards (AMST D3985-81), com a elevação da temperatura de 23 para 50 °C, a permeabilidade ao ar dos filmes plásticos aumenta de 3 a 5 vezes. Na escolha da lona é preferível optar pela cor branca, pois filmes de outras cores, especialmente os escuros, aumentam a permeabilidade ao O2 pela característica de absorver calor (TABACCO; BORREANI, 2002).
1.3. O desabastecimento do silo e o influxo de ar
Após a quebra da vedação, a face frontal do silo que não é rapidamente removida permanece exposta ao O2. A partir deste evento, o principal fator que determina a estabilidade da silagem (anaerobiose) é perdido e a massa se torna potencialmente instável (WEINBERG; ASHBELL, 2003). O influxo do O2 na face do silo é influenciado pela densidade alcançada durante a fase de enchimento (HONIG, 1991; PITT; MUCK, 1993; WEINBERG; ASHBELL, 2003). Assim, nas regiões mais porosas da massa (áreas periféricas) os riscos de deterioração aeróbia aumentam (D’AMOURS; SAVOIE, 2005).
O processo de deterioração aeróbia é originado pela atividade de microrganismos aeróbios. Desse modo, as perdas durante o desabastecimento também serão influenciadas pela disponibilidade de nutrientes, pela temperatura ambiental (ASHBELL et al., 2002) e pelo tempo de exposição da silagem ao O2 (WEINBERG; ASHBELL, 2003) e, segundo Ohyama; Masaki e Hara (1975), estes três fatores são interdependentes.
Teoricamente, a rota fermentativa mais desejável durante a conservação da forragem na forma de silagem é a do tipo homolática (conversão de uma molécula de glicose em duas de ácido lático), pois não propicia perdas de MS ou de energia, o que pode resultar em maior consumo de silagem pelos animais (McDONALD; HENDERSON; HERON, 1991).
Entretanto, o perfil de fermentação desejável nem sempre evita as perdas após a abertura dos silos, ou em alguns casos pode aumentá-las (KUNG; STOKES; LIN, 2003). A alta concentração e predominância de ácido lático em silagens necessariamente não representam efeito positivo na estabilidade aeróbia. Silagens adequadamente fermentadas, com altas concentrações de ácido lático e açúcares remanescentes, são mais afetadas pela deterioração aeróbia (WEINBERG; MUCK, 1996). Os fungos, as leveduras e algumas espécies de bactérias promovem a assimilação aeróbia de lactato da silagem, reduzindo o seu potencial de conservação (PAHLOW et al., 2003).
Portanto, a estratégia de restringir a formação de ácido acético aumenta os riscos de silagens serem instáveis durante a aerobiose (NUSSIO; PAZIANI; NUSSIO, 2002). O conceito de que a concentração de acetato menor que 2% MS classifica a silagem como excelente, como proposto no trabalho de Dulphy e Demarquilly (1981), é questionado na atualidade.
A habilidade em se estimar os riscos de deterioração aeróbia, de acordo com o perfil de fermentação, ainda é incerta. Porém, além de todos os cuidados relacionados com o manejo, a maior chance em obter sucesso na ensilagem está na premissa que as silagens devem conter ácido acético em associação ao ácido lático.
2. Aditivos controladores da deterioração de silagens
Até a metade da década de 90 o principal objetivo das indústrias era desenvolver estratégias com base no uso de bactérias homofermentativas. Entretanto, o meio científico iniciou pesquisas com uma cepa heterofermentativa (Lactobacillus buchneri), com o objetivo e empregar alternativas que controlassem a deterioração aeróbia durante a exposição da silagem ao ar (DRIEHUIS; SPOELSTRA; COLE, 1996; WEINBERG; MUCK, 1996).
Segundo Pahlow et al. (2003), as bactérias heteroláticas fermentam glicose, produzindo ácido lático e etanol, sendo que a frutose é fermentada a ácido lático, acético e manitol. Contudo, a espécie L. buchneri não possui a enzima acetaldeído desidrogenase, responsável pela redução de acetaldeído a etanol. Desse modo, a produção de etanol é reduzida (OUDE ELFERINK et al., 2001) e, conseqüentemente, ocorre aumento na concentração de ácido acético como produto final de sua fermentação (McDONALD; HENDERSON; HERON,1991).
A fermentação heterolática pode ser considerada desvantajosa, devido a possibilidade de maiores perdas de matéria seca durante o processo fermentativo (McDONALD; HENDERSON; HERON, 1991) e, também, porque elevadas concentrações de acetato na massa ensilada poderia reduzir o consumo voluntário por parte dos animais (CHARMLEY, 2001).
Entretanto, em regiões do silo onde a penetração de ar não pode ser controlada adequadamente (áreas marginais), assim como em situações onde se objetiva a redução da produção de etanol, como ocorre em silagens de cana-de-açúcar (NUSSIO; SCHIMIDT; PEDROSO, 2003), algum incremento no controle de perdas pode ser obtido utilizando este microrganismo.
O acetato é considerado um ácido pouco eficiente, quanto a função em reduzir o pH da silagem. No entanto, a sua ação ocorre sobre o metabolismo de leveduras e fungos filamentosos (MOON, 1983). Segundo Davidson (1997), este ácido em pH inferior ao seu pKa (4,73) permanece na forma não dissociada, onde a membrana dos microrganismos se torna permeável a ele, ocorrendo a entrada do ácido na célula via transporte passivo.
Dentro da célula, o ácido é dissociado (RCOO- + H+) devido ao pH ser próximo de 7,0, libera íons H+, o que reduz o pH intracelular. Para manter a acidez constante, o microrganismo deve eliminar os íons H+, perdendo energia neste processo, retardando o seu crescimento e podendo levar a morte da célula.
Driehuis; Oude Elferink e Spoelstra (1999) verificaram que a presença de L. buchneri em silagens de milho (92 dias de fermentação) reduziu a concentração de ácido lático, enquanto que a de ácido acético foi elevada conforme a população da bactéria aumentou. Segundo Oude Elferink et al. (2001), o L. buchneri consegue degradar o ácido lático em condições de anaerobiose, transformando-o em ácido acético, 1,2 propanodiol e traços de etanol. Além desta observação, Driehuis; Oude Elferink e Spoelstra (1999) verificaram elevadas concentrações de 1-propanol e ácido propiônico (236 e 106 mmol/kg MS, respectivamente) quando a silagem de milho foi inoculada com L. buchneri (1x106 ufc/g forragem).
Ranjit e Kung (2000), estudando a deterioração aeróbia em silagem de milho e utilizando o L. buchneri (1x106 ufc/g forragem) como um dos tratamentos, observaram aumento de 3,6 unidades percentuais na concentração de ácido acético em comparação com a silagem não tratada. As populações de leveduras foram de 106 e 102 ufc/g de silagem, nos tratamentos sem e com inóculo, respectivamente. A estabilidade aeróbia das silagens foi de 26,5 h para o tratamento controle e mais de 900 h para o tratamento com L. buchneri, constituindo-se em uma referência histórica comprobatória da efetividade dessa estratégia.
3. Microrganismos envolvidos com a deterioração aeróbia de silagens
3.1. Fungos
O reino Fungi é um grande grupo de organismos eucariontes, cujos membros são denominados fungos, representados pelas leveduras e fungos filamentosos (bolores). Os fungos são classificados num reino separado das plantas, animais e bactérias, sendo que a grande diferença é o fato de suas células apresentarem paredes celulares que contem quitina, ao contrário das células vegetais que contem celulose (ALEXOPOULOS; MIMS; BLACKWELL, 1996).
O conhecimento de que os fungos são microrganismos contaminantes de alimentos e de que seus produtos metabólicos são responsáveis por intoxicações alimentares no homem e nos animais domésticos data da Idade Média. Os primeiros quadros patológicos, ocorridos na França entre os séculos XI e XVI, foram constatados em populações que se alimentavam com pães elaborados a partir de farinha de centeio, contaminada com fungos. A doença caracterizada posteriormente como ergotismo produzia convulsões, gangrena seca das extremidades, e surgia de forma epidêmica em consequência da ingestão de micotoxinas presentes nos escleródios (esporão do centeio) do fungo Ascomiceto Claviceps purpúrea (PIER, 1973).
A micotoxicose foi inicialmente chamada de Fogo de Santo Antônio porque os romeiros, portadores da doença, quando se afastavam da fonte de infecção, em romaria ao túmulo de Santo Antônio de Pádua, na Itália, retornavam recuperados e às vezes até curados, fato esse considerado pelo povo na época como milagre (FORGACS; CARLL, 1962). Os animais domésticos também eram afetados pelos ergoalcalóides quando consumiam feno, centeio ou outros cereais contaminados pelo Claviceps purpurea. O ergostismo nesses animais se manifestava sob a forma gangrenosa e nervosa, dependendo das características do ergoalcalóide consumido.
As intoxicações pela ingestão de alimentos contaminados com toxinas produzidas por fungos foi uma constante ao longo do século passado. Durante a II Guerra Mundial duas epidemias importantes ocorreram na Rússia, em consequência do consumo de cereais contaminados por fungos. Em 1960 na Inglaterra, ocorreu a morte de 100.000 perus alimentados com rações que continham em sua formulação torta de amendoim importadas do Brasil, chamada de doença X dos perus. Segundo Morgavi e Riley (2007), a partir desse evento foram iniciados os estudos e a descoberta da aflatoxina.
Dentre as características dos fungos filamentosos, a biossíntese de produtos naturais os tornam de grande interesse para a comunidade científica. Seus metabólitos possuem contrastes marcantes, com funções diversas: as vezes útil no uso farmacêutico (penicilina) e por outro lado apresentando potentes propriedades tóxicas e carcinogênicas (aflatoxinas).
Segundo Hoffmeister e Keller (2007), os estudos sobre os metabólicos fúngicos datam de anos anteriores a 1870, onde pigmentos sintetizados por cogumelos atraíram a atenção dos químicos orgânicos da época. Já no século XX foi testemunhado, isolado e caracterizado quimicamente vasta diversidade de produtos naturais de fungos filamentosos, movido pela descoberta da penicilina.
Segundo Woolford (1990), a atenção direcionada aos microrganismos aeróbios em silagens só foi dada nas últimas duas décadas. Antes desse evento a presença de fungos na superfície de silagens, era tida como evento normal, inevitável, uma manifestação da fermentação ou perda intrínseca ocasionada por esta atividade.
3.2. Condições para desenvolvimento
A exigência mais óbvia para desenvolvimento fúngico é a necessidade de fontes de nitrogênio e energia. Um segundo requerimento é a temperatura ambiente. Embora os fungos possam coexistir sob grande diversidade de temperaturas, existem limites estabelecidos para seu crescimento e produção de toxinas (NELSON, 1992). Aspergillus e Penicillium são espécies que apresentam seu desenvolvimento ótimo em condições de temperatura elevada, enquanto que espécies de Fusarium tem preferência por menores temperaturas.
Os fungos filamentosos são organismos obrigatoriamente aeróbios, mesmo assim seu crescimento e proliferação podem ser controlados pela aeração durante o armazenamento de grãos, embora essa estratégia não seja opção no caso de preservação da silagem. Apesar da necessidade de ambiente aeróbio, algumas espécies de fungos são capazes de sobreviver em concentrações baixas de oxigênio, inferiores a 4% (MAGAN; LACEY, 1988).
Segundo Tuite (1969), a maioria dos fungos filamentosos necessita de ao menos 1 – 2% de oxigênio. Entretanto existe a exceção para a espécie Fusarium verticillioides, a qual é capaz de sobreviver em ambiente com 60% de CO2 e concentração de O2 inferior a 0,5%. Estas condições reforçam a ideia da necessidade de se realizar o processo de ensilagem de maneira rápida e eficiente, bem como realizar a vedação do silo de maneira adequada.
Fundamentalmente importante no crescimento de fungos é a água livre ou disponível no alimento, também denominada de atividade de água (Aw). A atividade de água é definida pela relação entre a pressão de vapor de determinado alimento e a pressão de vapor da água pura à mesma temperatura, com valores variando entre 0 e 1 (COULTATE, 1996).
À medida que se aumenta os valores para atividade de água, a velocidade de reações e crescimento microbiano é beneficiado. Os fungos são os microrganismos mais resistentes à diminuição da atividade de água, e alguns bolores, como é o exemplo de Monascus sp., podem crescer em condições de baixa atividade de água (0,62). Em ração total, a atividade de água pode variar entre valores de 0,50 a 0,94, sendo dependente da quantidade de silagem e do teor de matéria seca desse volumoso.
3.3. Os fungos e a silagem
Os fungos em geral são apontados como principais responsáveis pela deterioração aeróbia de silagens, com destaque para fungos filamentosos e leveduras. As populações de leveduras em silagens podem variar de < 102 ufc para valores de 1012 ufc/g forragem num intervalo de tempo de somente 3 dias. Além disso, a vulnerabilidade da silagem para deterioração aeróbia é função da população de leveduras, sendo que, caso a silagem apresente contagem de populações acima de 105 ufc/g forragem, o problema da deterioração já estará instalado no sistema.
As leveduras relacionadas com o processo de deterioração aeróbia têm sido classificadas dentro de dois grandes grupos: 1) utilizadoras de ácidos, grupo que compreende os gêneros Candida, Endomycopsis, Hansenula e Pichia e; 2) utilizadoras de açúcar, tendo o gênero Torulopsis como representante.
No caso de deterioração da silagem após a exposição ao ar, as leveduras utilizadoras de lactato serão as responsáveis pela maior magnitude da deterioração. Em estudo com 13 diferentes silagens de milho, Middlehoven e Franzen (1986) citados por Woolford (1990), observaram que a micoflora presente foi dominada por dois gêneros principais: Candida e Saccharomyces e, com a exceção da espécie S. dairensis, todas toleraram ácido acético no pH 4,0 e assimilaram os ácidos lático e acético, bem como, o etanol.
Utilizando combinação de métodos de plaqueamento e testes moleculares para identificação da população fúngica na planta de milho e sua silagem, Mansfield e Kuldau (2007) isolaram seis espécies de Penicillium (P. roqueforti, P. paneum, P. expasum, P. crustosum, P. commune e P. citrinum), sete espécies de Fusarium (F. avenaceum, F. culmorum, F. graminearum, F. pseudograminearum, F. proliferatum, F. sporotrichioides e F. verticillioides) e uma espécie de Aspergillus, A. fumigatus.
Em termos de abundância das espécies, P. roqueforti e F. graminearum foram as espécies prevalentes. P. roqueforti foi isolado em 50% das amostras de milho na colheita (n = 24) e em 75% das amostras de silagens (n = 24), enquanto F. graminearum foi encontrado em 58% de amostras na colheita e não foi verificado na silagem. P. paneum, que já foi relatado como sendo pertencente à espécie P. roqueforti e, recentemente designado nova espécie (BOYSEN; JACOBSSON; SCHNURER, 2000), foi isolado em amostras obtidas na colheita e nas silagens de milho.
Em adição as espécies micotoxigênicas isoladas, outras espécies de fungos filamentosos e leveduras foram isolados. Os gêneros de fungos filamentosos isolados incluíram: Acremonium, Cladosporium, Cordyceps, Epicoccum, Mortierella e Mucor. De maneira geral, as leveduras representaram o grupo majoritário entre os fungos isolados da silagem. Geotrichum candidum foi a espécie mais encontrada, sendo isolada em 75% das amostras da planta na colheita e 21% nas silagens. Outras espécies de leveduras que se apresentaram em altas concentrações incluíram: Candida intermédia, Candida sake, Debaryomyces hansenii, Issatchenkia orientalis, Pichia anomala, Pichia fermentans e Pichia membranifaciens.
3.4. Ocorrência de micotoxinas em silagens
Os fungos filamentosos podem ser considerados coadjuvantes na deterioração aeróbia de silagens, pois durante o desabastecimento do silo, o desenvolvimento deles acontece somente em sucessão ao crescimento das leveduras (McDONALD; HENDERSON; HERON,1991). Contudo, a deterioração aeróbia dos ingredientes de rações para animais causada por fungos filamentosos determina perda de elementos nutritivos e de energia (LINDGREN; OLDENBURG; PAHLOW, 2002), além do risco de contaminação com micotoxinas.
Recentemente, tem-se observado grande interesse em micotoxinas no que se refere à segurança alimentar, a despeito da origem e qualidade dos produtos destinados à alimentação humana. Dessa forma, um segmento que vem crescendo atualmente é o relacionado com triagem de micotoxinas em vários tipos de alimentos.
Micotoxinas são metabólitos secundários produzidos por fungos filamentosos que causam respostas tóxicas (micotoxicoses) quando ingerida por animais (BINDER et al., 2007). As plantas e forragens podem ser contaminadas pelas micotoxinas, de maneira geral, por dois meios: 1) patogenicidade fúngica e; 2) fungos saprofíticos (GLENN, 2007). Entretanto, a formação das micotoxinas não ocorre obrigatoriedade durante o desenvolvimento fúngico e, o mais importante: a detecção de fungos não implica necessariamente na presença de micotoxinas.
Muitas são as dúvidas e divergências sobre os estímulos que levam a formação dos metabólitos secundários pelos fungos filamentosos. Segundo Calvo et al. (2002), o metabolismo secundário dos microrganismos é comumente associado com o processo de esporulação, incluindo os fungos filamentosos.
Esses metabólitos secundários associados a esporulação podem ser agrupados em três grandes categorias: 1) metabólitos que ativam a esporulação (por exemplo, compostos derivados de ácido linoléico produzidos por Aspergillus nidulans; 2) Pigmentos requeridos para a estrutura de esporulação (por exemplo, melaninas necessárias para formação ou integridade dos esporos e; 3) metabólitos tóxicos secretados pelos colônias em crescimento no momento da esporulação (por exemplo, produção de micotoxinas).
A relação existente entre a produção da micotoxina e a esporulação do fungo foi documentada em muitos gêneros de fungos micotoxigênicos. Em Aspergillus parasiticus, alguns produtos químicos que inibem sua esporulação também fazem que ocorra inibição da produção de aflatoxina (REIB, 1982). Alguns trabalhos científicos têm apresentado que espécies mutantes de Aspergillus deficientes na esporulação também são incapazes de produzir aflatoxinas (CALVO et al., 2002).
Fox e Howlett (2008) destacaram o papel dos metabólitos secundários na biologia dos fungos. Segundo os autores, em muitos casos, o motivo para a produção de toxinas pelos fungos é dado pela falta de resposta do hospedeiro (planta), se o mesmo permitirá a completar seu ciclo de vida. Dessa maneira, sem resposta a população fúngica presente produz toxinas.
A conclusão dos autores é de que os metabólitos secundários produzidos por fungos filamentosos ainda não são compreendidos claramente, envolvendo algumas proteínas e complexos que respondem a vários estímulos ambientais e do hospedeiro.
3.5. Presença de micotoxinas no campo
Os fungos podem se desenvolver em vários tipos de ambiente, sendo que em condições de campo o gênero Fusarium tem predominância de crescimento. A exigência mínima para o desenvolvimento de fungos do gênero Fusarium é elevada umidade (>70%), oxigênio e temperaturas flutuantes (dias quentes e noites frias). Esse gênero é responsável por ampla gama de doenças de gramíneas e cereais.
Em lavouras de milho, esses têm capacidade de causar podridões em partes distintas da planta, tais como: caule, espiga e grão. Em trigo e outros cereais de inverno, Fusarium causa uma doença chamada de ferrugem do trigo (head scab), considerada bem importante para essas culturas.
A eliminação de esporos de Fusarium do ambiente é impraticável, uma vez que esses hibernam durante o inverno no solo, em detritos de plantas ou nas sementes. Sendo assim, o contato do esporo com a planta será inevitável e o grau de infecção será determinado em função das condições de ambiente e de estresse da planta. Segundo Rankin e Grau (2002), a competição por nutrientes na planta se estabelece entre a própria planta e outros microrganismos, e nesta ocasião, os fungos presentes produzem micotoxinas como forma de obter vantagens na competição por alimento.
Segundo Jouany (2007), existem mais de 500 micotoxinas conhecidas, entretanto as espécies de fungos e as toxinas mais conhecidas, pertencentes aos gêneros Fusarium são: Deoxinivalenol (DON), produzida por F. molinoforme e F. graminearum; Toxina T2, produzida por F. sporotrichioides; Zearalenona, produzida por F. graminearum e; Fumonisina, produzida por F. moliniforme.
De maneira geral, a cultura implantada deve ter um programa balanceado para ajustes na fertilidade do solo com vistas à redução do estresse da planta e, consequentemente, incidência de doenças. Segundo Rankin e Grau (2002), o nitrogênio (N) e o potássio (K) estão diretamente associados com o aumento na podridão dos colmos em milho. Tanto o excesso como baixas concentrações desses nutrientes conduzem para aumento da incidência dessa doença, o que gera grande probabilidade de produção de micotoxinas.
A escolha do híbrido poderá influir na susceptibilidade ao ataque fúngico, com consequente produção de toxinas. Segundo Jouany (2007), o melhoramento de plantas pode ser uma solução para controle de Fusarium, entretanto, com a melhoria na resistência ao seu ataque, a qualidade de híbridos é afetada. Miedaner et al. (2006) verificaram que o gene associado a resistência aos fungos do gênero Fusarium em trigo são coincidentes com genes que controlam as características morfológicas da planta, havendo conflitos de interesses.
O momento da colheita da planta também é caráter decisório para produção de micotoxinas. Oldenburg e Höppner (2003) verificaram aumento de amostras positivas para deoxinivalenol à medida que o milho foi colhido mais tardiamente. Em plantas de milho colhidas com 30% de MS, os autores obtiveram 34% de amostras positivas (n=82), ao passo que quando a planta foi colhida com 40% de MS, 86% das amostras (n=50) se apresentaram contaminadas pela micotoxina.
A textura do grão é uma característica dos híbridos que vem sendo discutida com relação a qualidade nutricional e a susceptibilidade ao ataque fúngico. Apesar de híbridos de milho com grãos dentados (textura macia) apresentarem maior qualidade nutricional, (maior facilidade ao ataque enzimático para digestão), estes também apresentam maior suscetibilidade a incidências de doenças e ataques de insetos, o que gera porta de entrada para colonização de fungos (RANKIN; GRAU, 2002).
Atualmente, grande foco tem sido dado aos híbridos de milho transgênicos (híbridos Bt), aos quais foram inseridos genes de Bacillus thuringiensis que levam à produção de proteínas tóxicas a determinadas ordens de insetos considerados pragas na cultura. A premissa para redução de fungos e, consequentemente, micotoxinas nesses híbridos é de que a integridade da planta será preservada por menor quantidade de ataques de insetos, fazendo com que a planta apresente menor quantidade de portas de entrada para esporos de fungos e sua posterior colonização nos tecidos da planta (HAMMOND et al., 2004).
Adicionalmente, práticas agronômicas como a rotação de culturas, controle de pragas e doenças devem ser consideradas para redução da infestação fúngica.
3.5.1. Presença de micotoxinas durante o período fermentativo da silagem
De acordo com a classificação de Pelhate (1977) para fungos filamentosos em silagens, as espécies do gênero Fusarium são estritamente aeróbias. Espécies de fungos como Aspergillus fumigatus, Monascus ruber, Penicillium varioti e Penicillium roqueforti são consideradas micro-aerofílicas ou indiferentes a presença de oxigênio.
Auerbach (1996) verificou que a população de fungos em silagem de milho decresceu ao longo do período de fermentação em condições estritamente anaeróbias. A partir do 10° dia após a ensilagem, Penicillium roqueforti foi a única espécie presente até o 100° dia de fermentação. Em contraste a esse fato, a simulação com o suprimento adicional de oxigênio durante o processo de fermentação (100 mg O2/kg MS/dia) estimulou o crescimento da população fúngica e aumentou a diversidade de espécies não somente representados pela espécie Penicillium roqueforti.
Outro fator que contribui para a sucessão da micoflora em silagens durante a fermentação é a variação no pH causada pela produção dos ácidos orgânicos, tal como lático, acético, propiônico e butírico. Embora o pH per se não afete os fungos filamentosos, podendo estes crescer ou permanecerem dormentes em amplitude larga de valores, entre 3 a 8, a variação nesse parâmetro pode influenciar sua susceptibilidade a outros fatores ambientais (LACEY, 1989).
A resistência dos esporos de fungos para ácidos orgânicos tem se mostrado variável entre as espécies. Segundo Woolford (1975), o ácido lático não apresenta efeito prejudicial importante ao crescimento fúngico, ao passo que os ácidos orgânicos de cadeia curta (acético, propiônico e butírico) são potentes inibidores de fungos. Esporos de Penicillium roquerforti mostraram-se menos sensíveis a ação do ácido propiônico em relação à outras espécies do gênero Penicillium e Aspergillus (Auerbach, 1996).
Auerbach; Oldenburg e Weissbach (1998) verificaram predominância de Penicillium roqueforti tanto em silagens de gramíneas emurchecidas como em silagens de milho. Segundo os autores, essa espécie tem habilidade de crescer em baixas concentrações de oxigênio, altas concentrações de dióxido de carbono, baixas temperaturas e na presença de ácidos orgânicos voláteis.
Tanto a silagem de gramínea emurchecida como a silagem de milho apresentaram maior contagem fúngica nas amostras consideradas visualmente contaminadas com a presença de micélios. Entretanto, os valores encontrados para roquefortina C foram maiores na silagem de milho, o que pode ser explicado em função da maior concentração de ácido lático e componentes solúveis, ou seja, a mesma abundância de substratos para o desenvolvimento fúngico e produção de micotoxinas não foi encontrada na silagem de gramínea.
3.5.2. Presença de micotoxinas no período de pós abertura do silo
Após a quebra da vedação, a face frontal do silo permanece exposta ao O2. A partir deste evento, o principal fator que determina a estabilidade da silagem (anaerobiose) é perdido e a massa se torna potencialmente instável (WEINBERG; ASHBELL, 2003). O influxo do O2 na face do silo é influenciado pela densidade alcançada durante a fase de enchimento (HONIG, 1991; PITT; MUCK, 1993; WEINBERG; ASHBELL, 2003). Assim, nas regiões mais porosas da massa (áreas periféricas) aumentam os riscos de deterioração aeróbia (D’AMOURS; SAVOIE, 2005).
O processo de deterioração aeróbia é originado pela atividade de microrganismos aeróbios. Desse modo, as perdas durante o desabastecimento também serão influenciadas pela disponibilidade de nutrientes, pela temperatura ambiental (ASHBELL et al., 2002) e pelo tempo de exposição da silagem ao O2 (WEINBERG; ASHBELL, 2003) e, segundo Ohyama; Masaki e Hara (1975), estes três fatores são interdependentes.
Teoricamente, a rota fermentativa mais desejável durante a conservação da forragem na forma de silagem é a do tipo homolática (conversão de uma molécula de glicose em duas de ácido lático), pois não propicia perdas de MS ou de energia, o que pode resultar em maior consumo de silagem pelos animais (McDONALD; HENDERSON; HERON, 1991).
Entretanto, o perfil de fermentação desejável nem sempre evita as perdas após a abertura dos silos, ou em alguns casos pode inclusive aumentá-las (KUNG; STOKES; LIN, 2003). A alta concentração e predominância de ácido lático em silagens necessariamente não representam efeito positivo na estabilidade aeróbia.
Silagens adequadamente fermentadas, com altas concentrações de ácido lático e açúcares remanescentes, são mais afetadas pela deterioração aeróbia (WEINBERG; MUCK, 1996). Os fungos, as leveduras e algumas espécies de bactérias promovem a assimilação aeróbia de lactato da silagem, reduzindo o seu potencial de conservação (PAHLOW et al., 2003).
Os fungos filamentosos podem ser considerados coadjuvantes na deterioração aeróbia de silagens, pois, durante o desabastecimento do silo, o desenvolvimento deles acontece em sucessão ao crescimento das leveduras (McDONALD; HENDERSON; HERON, 1991).
Driehuis et al. (2008) realizaram na Holanda o monitoramento de 24 fazendas produtoras de leite. Amostras tanto de silagem de milho como de gramíneas foram utilizadas, sendo colhidas em diferentes regiões do painel dos silos (centro, topo e regiões visualmente mofados). Adicionalmente, amostras da mistura de silagens, as quais eram oferecidas para os animais, foram coletadas. Os resultados indicaram que a silagem foi a principal fonte de contaminação com micotoxinas.
Silagem de gramínea apresentou baixas concentrações de zearalenona (ZEA), roquefortina C (RC) e ácido micofenólico (AMF) e não houve a presença de deoxinivalenol (DON). Em relação aos locais de coleta das amostras, as concentrações de DON e ZEA foram idênticas tanto para a superfície como para o topo do silo, ao contrário para os valores de RC e AMF que apresentaram maiores concentrações na região do topo dos silos.
Micotoxinas como aflatoxinas, fumonisinas, ocratoxina A, patulina e toxina T2 não foram identificadas no presente estudo. Segundo os autores, apesar de não haver presença dessas micotoxinas, a literatura se reporta com relativa frequência a presença dessas em silagens, coprodutos e ingredientes concentrados.
Particularmente para aflatoxina B1, a não contaminação das silagens foi relacionada com as condições ambientais encontradas (baixa temperatura), fato que provavelmente impediu seu desenvolvimento. Baixos índices de aflatoxina B1 (0,92%) e ocratoxina A (6,1%) foram verificados em silagens de milho por Schmidt et al. (2011), indicando condições climáticas como um dos responsáveis pela baixa incidência.
As aflatoxinas representam as micotoxinas que mais causam preocupação, pois apresentam propriedades carcinogênicas, mutagênicas e teratogênicas, causando grandes danos à saúde humana e elevados prejuízos econômicos no desempenho de animais domésticos, como os ruminantes (LAZZARI, 1997). São produzidas principalmente pelas espécies Aspergillus flavus e A. parasiticus, presentes em vegetais como o amendoim, o milho e o caroço de algodão.
A aflatoxina B1 (AFB1) é considerada uma das mais tóxicas produzidas por estas espécies. No fígado a AFB1 é biotransformada à aflatoxina M1 (AFM1), a qual é excretada no leite de animais em lactação (BATTACONE et al., 2005). Acreditava-se que a taxa de passagem da micotoxina do alimento para o leite era de 2%.
Porém, estudos recentes colocaram em evidência que tal taxa está correlacionada com dois fatores: potencial produtivo do animal e estágio de lactação. Os valores de 2 a 2,5% referem-se a vacas com produção entre 16-25 kg/dia em estágio de lactação avançado. Como os animais estão se tornando cada vez mais produtivos, com produção superior a 30 kg de leite, a taxa se torna mais elevada, com valores próximos a 4% (VELDMAN et al., 1992).
4. Considerações finais
Todas as etapas envolvidas com o processo de ensilagem colaboram para ocorrência da deterioração de silagens, desde o momento da colheita, passando pelo enchimento e compactação, vedação e pós abertura.
Fungos filamentosos e micotoxinas são contaminantes comumente encontrados em plantas forrageiras e silagens de várias localidades do mundo e são tidos como potenciais causadores de danos à saúde de animais de interesse zootécnico e aos humanos.
As micotoxinas estão presentes em todas as etapas do processo de ensilagem, desde a colheita, passando pela fermentação e chegando ao cocho do animal, sendo que os gêneros Fusarium, Penicillium e Aspergillus são os maiores representantes das contaminações. Apesar de alguns autores se apoiarem na definição de que micotoxinas são produzidas por fungos em momentos de aumento de competição no ambiente, muitos resultados mostram que realmente o mecanismo para produção de determinada toxina ainda não está claramente compreendido. Provavelmente, outros fatores além da competição e estímulos ambientais possam contribuir para produção dessas toxinas, como espécie fúngica, inter-relações entre microrganismos e tipo de alimento a ser deteriorado.
O correto manejo da lavoura, do processo de ensilagem e do período pós abertura do silo são fundamentais para minimizar a contaminação por fungos e micotoxinas. Respeitando esses princípios, certamente ocorrerá redução nas perdas de nutrientes pelo desenvolvimento fúngico e, principalmente, redução dos efeitos tóxicos causados por seus metabólitos no desempenho e saúde do animal.
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Fonte
DE ALMEIDA, Gercílio Alves Júnior; STRADIOTTI Deolindo Júnior; DA SILVA, Elaine Cristina Gomes; ANDRADE; Magda Aparecida Nogueira; DE ALMEIDA, Maria Izabel Vieira; CÓSER, Antônio Carlos. Avanços Tecnológicos na Bovinocultura de Leite. 1ª ed. Alegre - ES: CAUFES, 2012.
